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            RTD6143明膠酶譜分析試劑盒
             產品貨號: RTD6143
             產品名稱: RTD6143明膠酶譜分析試劑盒
             產品價格/規格: 50次 1500元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-06-07
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            • 明膠酶譜分析試劑盒

                    Gelatin Zymography Analysis Kit    Ver.710278

              貨號

              名稱

              規格

              RTD6143

              明膠酶譜分析試劑盒

              50


              產品組成:

              貨號

              名稱

              規格

              保存

              RTD6143-01

              4%濃縮膠聚合溶液A2×)

              40 ml

              4

              RTD6143-02

              4%彩色濃縮膠溶液B2×)

              40 ml

              4

              RTD6143-03

              10%分離膠聚合溶液A2.5×)

              100 ml

              4

              RTD6143-04

              10%分離膠膠溶液B2×)

              125 ml

              4

              RTD6143-05

              10×明膠底物

              30 ml

              RT (配制后-20)

              RTD6143-06

              10×復性緩沖液

              250 ml

              4

              RTD6143-07

              10×孵育緩沖液

              500 ml

              4

              RTD6143-08

              膠原酶陽性對照

              0.5 ml

              -20

              RTD6202

              FastBlue蛋白染色液

              500 ml

              RT

              PL112

              5×蛋白上樣緩沖液 (變性,非還原)

              1 ml

              -20

              TG120P

              5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(干粉)

              1 L

              RT

              AP020P

              APS(干粉)

              0.5 g

              RT (配制后-20)

              TA0761

              TEMED

              0.5 ml

              4,避光

              說明書

              一份

              產品簡介:

              基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一種鋅依賴性酶,能切割細胞外基質成分,能在一定條件下水解明膠。細胞內的MMP以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白,通過影響細胞外基質,參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。

              本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性,其基本原理和程序是:制備含有膠原酶底物明膠的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,電泳時,SDS與樣本中的MMP可逆性結合,導致MMP氫鍵和疏水鍵被破壞而不能發揮分解明膠的作用。電泳結束后取出凝膠與孵育溶液孵育,MMP恢復活性,在其遷移位置水解凝膠中的明膠,考馬斯亮藍染色后凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮白色區域,從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,其強弱與MMP活性呈正比。

              本試劑盒提供明膠酶譜分析的全套試劑,試劑盒可進行50 次標準膠(8×10 cm)檢測,如果小膠加樣孔為10~15個,則總計可檢測500~750 個樣品。試劑盒配套有膠原酶陽性對照,可以有效分解明膠,方便判斷凝膠及電泳體系是否有問題。

              貯存及運輸:

                  按照試劑盒標簽貯存;常溫運輸;開封后試劑盒有效期一年。

              使用說明:

              1. 10% APS配制-5 ml

              將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中,徹底溶解后分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為一周,-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長,應考慮更換使用-20度保存的10%APS。

              2. 10×明膠底物配制:

              明膠粉末加入30 ml滅菌水,60℃水浴中徹底融化,冷卻至常溫后使用。明膠底物配制后-20℃貯存。

              分離膠制備:

              1.1參照凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

              1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合;最后加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡。

               

               

              10%分離膠

              4%濃縮膠

               

               

              5 ml

              1.6 ml

              加入順序

              組份

              1.0 mm厚度凝膠

              1

              10%分離膠聚合溶液A2.5×

              2.0 ml

              -

              2

              10%分離膠膠溶液B

              2.5 ml

              -

              3

              10×明膠底物

              0.5 ml

              -

              4

              4%濃縮膠聚合溶液A

              -

              0.8 ml

              5

              4%彩色濃縮膠溶液B

              -

              0.8 ml

              6

              10 APS

              50 μl

              16 μl

              7

              TEMED

              5 μl

              1.6 μl

              1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層無水乙醇,使凝膠表面保持平整。

              1.4靜置5-10分鐘,待分離膠和乙醇層之間出現一個清晰的界面后,說明凝膠已聚合

              濃縮膠制備:

              2.1去除覆蓋在分離膠上的乙醇層。

              2.2按照表格將不同體積成分在一個小燒杯中混合;最后加入10%過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡。

              2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。

              2.4將梳子插入凝膠內,避免產生氣泡。

              2.5靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合(25℃ 標準凝固時間為50分鐘)。

              注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長?梢愿鶕砀駱藴蕳l件調節催化劑的加入量。

              電泳:

              3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液的配制:

                 將一包干粉全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L(此溶液不用調節pH值,pH 8.3-8.5)。電泳前將緩沖液稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。

              3.2 樣品處理:融化-混合-上樣

              3.2.1 將5×蛋白上樣緩沖液(變性,非還原)常溫融化后混勻。

              3.2.2 將上樣緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻。

              注:由于MMP活性需要二價陽離子,蛋白樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等。

              蛋白樣品提取可以選擇RL0120F RIPA裂解液(強,不含抑制劑,不含螯合劑)

              3.2.3 快甩離心收集到管底,常溫放置5-10分鐘,不要加熱處理樣品,上樣電泳。

                   膠原酶陽性對照同時上樣5-10 μl。

              3.3 電泳:

                 在電泳槽的內槽加入1×電泳緩沖液,輕輕撥出梳子,沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣,恒電壓150 V電泳。

              電泳條件(一板膠)

              恒電壓

              起始電流

              終止電流

              電泳時間

              可選

              150V

              30-40mA

              8-15mA

              50 min+

              冰浴電泳

              MMP檢測:

              4.1 漂洗:

              取出凝膠,放入容器內,加入50 ml蒸餾水漂洗凝膠,搖床慢搖5分鐘,重復一次。

              4.2 復性:

              4.2.1  1×復性緩沖液配制:

              將10×復性緩沖液用蒸餾水稀釋10倍,如10 ml 10×復性緩沖液加90 ml蒸餾水。

              注:如10×復性緩沖液由于低溫貯存有析出時,37℃徹底溶化后再使用。

              4.2.2 復性:

              取出凝膠,棄蒸餾水,加入50 ml 1×復性緩沖液,搖床慢搖30分鐘。

              注:復性結束后,凝膠呈乳白半透明狀。

              4.3 孵育:

              4.3.1 1×孵育緩沖液配制:

              將10×孵育緩沖液用蒸餾水稀釋10倍,如10 ml 10×孵育緩沖液加90 ml蒸餾水。

              4.3.2 孵育:

              倒掉1×復性緩沖液,加入50 ml 1×孵育緩沖,37℃ 搖床慢搖10分鐘;

                   棄1×孵育緩沖液,加入 50 ml 1×孵育緩沖,37℃ 搖床慢搖4小時-過夜孵育。

              注:陽性對照-膠原酶IV通常37℃孵育3-4小時即可消化凝膠中的明膠。如樣品中MMP 活性低,應延長孵育時間至過夜。

              4.4 顯色:

              4.4.1 漂洗:倒掉孵育液,凝膠中加入50 ml蒸餾水,搖床慢搖5分鐘,重復一次。

              4.4.2 棄蒸餾水,加入50 ml FastBlue染色液(以剛剛覆蓋過膠面為適),搖床上常溫搖動30分鐘-2小時,凝膠大部分區域被深染,在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。

              五 實驗示例:


              10%分離膠(含明膠底物)

              電泳條件:1×TGS 150V 36-12mA 90 min

              實驗步驟:

                  漂洗:蒸餾水漂洗兩次;

              復性:50 ml 1×復性緩沖液常溫復性30分鐘;

                            孵育:50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育10分鐘;

                            50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育15小時;

              漂洗:蒸餾水漂洗兩次;

                            染色:FastBlue染色60分鐘。

                            實驗結果:膠原酶消化明膠底物,在70-130 kD區間產生明亮條帶。



            • 明膠酶譜分析試劑盒

              使用該產品發表部分文章列表:

              1. [2021 IF=3.5] Salidroside protects against ventilation-induced lung injury by inhibiting the expression of matrix metalloproteinase-9.

              Author: Hui Zhang, Wenwen Dong, Siyuan Li, Yunqian Zhang, Zhou Lv, Lu Yang, Lai Jiang, Tao Wu & Yan Wang.

              Journal: Pharmaceutical Biology. 2021, VOL. 59, NO. 1, 760–768

              Institution Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

              Paper linkhttps://doi.org/10.1080/13880209.2021.1967409

               

              2. [2021 IF=2.73] Synovial mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles alleviate chondrocyte damage during osteoarthritis through microRNA-130b-3p-mediated inhibition of the LRP12/AKT/β-catenin axis.

              Author: Zhenhua Zeng, Yi Dai, Shuo Deng, Sanbao Zou, Tingyang Dou & Feng Wei.

              Journal: Immunopharmacology and Immunotoxicology. Published in 2022

              Institution Department of Pain, the First People's Hospital of Jiashan County, Jiaxing

              Paper linkhttps://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08923973.2022.2038192

               

              3. [2021 IF=4.5] CXCL13 as a Novel Immune Checkpoint for Regulatory B Cells and Its Role in Tumor Metastasis.

              Author: Jun Ren, Tianxia Lan, Ting Liu, Yu Liu, Bin Shao, Ke Men, Yu Ma, Xiao Liang,Yu-quan Wei, Min Luo, and Xia-wei Wei

              Journal: The Journal of Immunology Published April 18, 2022

              Institution West China Second Hospital, Sichuan University

              Paper link http://www.jimmunol.org/cgi/doi/10.4049/jimmunol.2100341

               


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