明膠酶譜分析試劑盒
Gelatin Zymography Analysis Kit Ver.710278
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貨號
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名稱
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規格
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RTD6143
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明膠酶譜分析試劑盒
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50次
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● 產品組成：
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貨號
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名稱
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規格
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保存
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RTD6143-01
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4%濃縮膠聚合溶液A（2×）
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40 ml
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4℃
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RTD6143-02
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4%彩色濃縮膠溶液B（2×）
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40 ml
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4℃
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RTD6143-03
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10%分離膠聚合溶液A（2.5×）
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100 ml
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4℃
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RTD6143-04
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10%分離膠膠溶液B（2×）
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125 ml
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4℃
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RTD6143-05
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10×明膠底物
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30 ml
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RT (配制后-20℃)
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RTD6143-06
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10×復性緩沖液
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250 ml
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4℃
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RTD6143-07
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10×孵育緩沖液
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500 ml
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4℃
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RTD6143-08
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膠原酶陽性對照
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0.5 ml
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-20℃
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RTD6202
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FastBlue蛋白染色液
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500 ml
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RT
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PL112
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5×蛋白上樣緩沖液 (變性，非還原)
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1 ml
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-20℃
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TG120P
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5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(干粉)
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1 L
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT (配制后-20℃)
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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說明書
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一份
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● 產品簡介：
基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一種鋅依賴性酶，能切割細胞外基質成分，能在一定條件下水解明膠。細胞內的MMP以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，通過影響細胞外基質，參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。
本試劑盒采用酶譜法（Zymography）檢測MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物明膠的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳時，SDS與樣本中的MMP可逆性結合，導致MMP氫鍵和疏水鍵被破壞而不能發揮分解明膠的作用。電泳結束后取出凝膠與孵育溶液孵育，MMP恢復活性，在其遷移位置水解凝膠中的明膠，考馬斯亮藍染色后凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮白色區域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及活性，其強弱與MMP活性呈正比。
本試劑盒提供明膠酶譜分析的全套試劑，試劑盒可進行50 次標準膠（8×10 cm）檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750 個樣品。試劑盒配套有膠原酶陽性對照，可以有效分解明膠，方便判斷凝膠及電泳體系是否有問題。
● 貯存及運輸：
按照試劑盒標簽貯存；常溫運輸；開封后試劑盒有效期一年。
● 使用說明：
1. 10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10%APS。
2. 10×明膠底物配制：
明膠粉末加入30 ml滅菌水，60℃水浴中徹底融化，冷卻至常溫后使用。明膠底物配制后-20℃貯存。
一 分離膠制備：
1.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產生氣泡。
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10%分離膠
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4%濃縮膠
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5 ml
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1.6 ml
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加入順序
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組份
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1.0 mm厚度凝膠
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1
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10%分離膠聚合溶液A（2.5×）
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2.0
ml
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-
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2
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10%分離膠膠溶液B（2×）
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2.5
ml
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-
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3
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10×明膠底物
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0.5
ml
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-
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4
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4%濃縮膠聚合溶液A（2×）
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-
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0.8
ml
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5
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4%彩色濃縮膠溶液B（2×）
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-
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0.8
ml
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6
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10％ APS
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50
μl
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16
μl
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7
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TEMED
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5
μl
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1.6
μl
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1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層無水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置5-10分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合
二 濃縮膠制備：
2.1去除覆蓋在分離膠上的乙醇層。
2.2按照表格將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產生氣泡。
2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。
2.4將梳子插入凝膠內，避免產生氣泡。
2.5靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合（25℃
標準凝固時間為50分鐘）。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長�？梢愿鶕砀駱藴蕳l件調節催化劑的加入量。
三 電泳：
3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液的配制：
將一包干粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L（此溶液不用調節pH值，pH 8.3-8.5）。電泳前將緩沖液稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
3.2 樣品處理：融化-混合-上樣
3.2.1 將5×蛋白上樣緩沖液（變性，非還原）常溫融化后混勻。
3.2.2 將上樣緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻。
注：由于MMP活性需要二價陽離子，蛋白樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等。
蛋白樣品提取可以選擇RL0120F RIPA裂解液(強，不含抑制劑，不含螯合劑)
3.2.3 快甩離心收集到管底，常溫放置5-10分鐘，不要加熱處理樣品，上樣電泳。
膠原酶陽性對照同時上樣5-10 μl。
3.3 電泳：
在電泳槽的內槽加入1×電泳緩沖液，輕輕撥出梳子，沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×電泳緩沖液。上樣，恒電壓150 V電泳。
電泳條件（一板膠）
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恒電壓
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起始電流
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終止電流
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電泳時間
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可選
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150V
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30-40mA
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8-15mA
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50 min+
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冰浴電泳
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四 MMP檢測：
4.1 漂洗：
取出凝膠，放入容器內，加入50 ml蒸餾水漂洗凝膠，搖床慢搖5分鐘，重復一次。
4.2 復性：
4.2.1
1×復性緩沖液配制：
將10×復性緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×復性緩沖液加90 ml蒸餾水。
注：如10×復性緩沖液由于低溫貯存有析出時，37℃徹底溶化后再使用。
4.2.2 復性：
取出凝膠，棄蒸餾水，加入50 ml 1×復性緩沖液，搖床慢搖30分鐘。
注：復性結束后，凝膠呈乳白半透明狀。
4.3 孵育：
4.3.1 1×孵育緩沖液配制：
將10×孵育緩沖液用蒸餾水稀釋10倍，如10 ml 10×孵育緩沖液加90 ml蒸餾水。
4.3.2 孵育：
倒掉1×復性緩沖液，加入50 ml 1×孵育緩沖，37℃
搖床慢搖10分鐘；
棄1×孵育緩沖液，加入 50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢搖4小時-過夜孵育。
注：陽性對照-膠原酶IV通常37℃孵育3-4小時即可消化凝膠中的明膠。如樣品中MMP 活性低，應延長孵育時間至過夜。
4.4 顯色：
4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝膠中加入50 ml蒸餾水，搖床慢搖5分鐘，重復一次。
4.4.2 棄蒸餾水，加入50 ml FastBlue染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），搖床上常溫搖動30分鐘-2小時，凝膠大部分區域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。
五 實驗示例：
10%分離膠（含明膠底物）
電泳條件：1×TGS
150V 36-12mA 90 min
實驗步驟：
漂洗：蒸餾水漂洗兩次；
復性：50 ml 1×復性緩沖液常溫復性30分鐘；
孵育：50
ml 1×孵育緩沖液37度孵育10分鐘；
50
ml 1×孵育緩沖液37度孵育15小時；
漂洗：蒸餾水漂洗兩次；
染色：FastBlue染色60分鐘。
實驗結果：膠原酶消化明膠底物，在70-130 kD區間產生明亮條帶。
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