植物原生質體制備試劑盒                                        

●  產品組成：

● 產品簡介：

植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。試劑盒配套的酶混合物是纖維素酶R-10和離析酶R-10的混合物，優化的酶配比能很好地消化植物細胞壁，提取到良好的植物原生質體。

按照每次使用5 ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于20次酶消化反應。本試劑盒每個5 ml反應體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5 ml體系可獲得約50-70萬個原生質體(不同植物不同操作會有一定的差異)，可滿足約25-70個樣品的原生質體質粒轉染操作(按照每樣1-2萬個細胞計算)。

本試劑盒不含有原生質體轉化試劑，需要轉化請參見植物原生質體轉化試劑盒（RTU4092 ）。

● 貯存、效期及運輸：

  按照標簽溫度保存，至少一年有效。-20℃貯存組分4℃存放3-4不會影響使用效果。3-4天經常使用的情況，可以全部保存在4℃。

試劑盒常溫運輸。

● 使用說明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   平頭鑷子；一次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水浴鍋

一、原生質體分離：

即用型酶溶液配制

注：溶液I容易被微生物污染，使用時須嚴格按照無菌操作規范進行或者適當分裝后使用。

55℃處理能滅活核酸酶和蛋白酶并促進酶的溶解；

即用型酶溶液現用現配，不建議配制后凍存后再使用；

溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。

1. 酶解：

取生長狀態良好的葉片切成0.5-1 mm的小條，按照0.1 克葉片（擬南芥約15-20個葉片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。

注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態有關，請根據實驗需要適當調整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變為綠色表明有原生質體已經有分離，溶液為濃綠色表明原生質體已經大量分離。擬南芥原生質體大小約為30-50 μm，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細胞內，說明狀態較好；如呈現不規則形狀，說明原生質

體破碎或即將破碎。

 2. 漂洗：

        取適量溶液II-漂洗溶液（5×），用超純水稀釋為1×漂洗溶液。

酶解后加入等體積的1×漂洗溶液，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml 1×漂洗溶液，輕柔混勻。

3. 過濾：

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，用5-10 ml 1×漂洗溶液沖洗酶解器皿和未消化的葉片1-2次，將所有的液體收到50 ml離心管中。

4. 第一次收集：

濾出液100g常溫離心 2分鐘，盡量去除上清。

注：為了避免原生質體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉頭；離心時，可調低離心機的升速和降速。升速過快，原生質體可能離到管壁上；降速過快，可能導致管底原生質體懸起。建議升速和降速分別都使用3。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 1×漂洗溶液，用剪尖的藍吸頭重懸原生質體，冰浴30分鐘，原生質體在重力

作用下可以沉降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質體。(如果發現原生質體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生質體)。

6. 重懸：

小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質體溶液。（可以用血球計數板計數，根據原生質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生質體密度為2×10⁵/ml或更高）。

注：制備好的原生質體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、實驗示例：

                使用植物原生質體制備試劑盒轉染擬南芥原生質體的效果圖。

實驗步驟：稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液后，顛倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物用綠色熒光蛋白)，加入100 μl制備好的原生質體，輕柔混勻后加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜置5 min后加入440 μl 1×漂洗溶液終止轉化，輕輕顛倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上清，再加入0.5 ml 1×漂洗溶液，輕柔重懸原生質體，常溫100 g離心1 min后，盡量去除上清，收集原生質體。加入1 ml溶液V，小心重懸原生質體后水平放置25℃培養過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold       resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：擬南芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x