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            ·PCR
             
             
             





            PU1060 植物Rubisco活性測定試劑盒(停產)
             產品貨號: PU1060
             產品名稱: PU1060 植物Rubisco活性測定試劑盒(停產)
             產品價格/規格: 80-100次
             產品說明書: 暫無
             更新時間: 2022-03-22
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              植物Rubisco測定試劑盒

              產品組成:Plant Rubisco Assay Kit

              組分貨號

              名稱

              規格

              貯存

              運輸

              PU1060-01

              試劑1-Rubisco提取緩沖液(2×)

              100 ml

              4

              常溫

              PU1060-02

              試劑2-10×Assay buffer

              15 ml

              -20℃

              常溫

              PU1060-03

              試劑3-GAPDH200×)

              1 KU/1ml

              -20℃

              常溫

              PU1060-04

              試劑4-PGK100×)

              500 U/1ml

              4℃

              常溫

              PU1060-05

              試劑5-CPK100×)

              1 KU/1ml

              -20℃

              常溫

              PU1060-06

              試劑6-ATP100×)

              1.2 ml

              -20

              常溫

              PU1060-07

              試劑7-CrP100×)

              1.2 ml

              -20

              常溫

              PU1060-08

              試劑8-NADH100×)

              1.2 ml

              -20

              常溫

              PU1060-09

              試劑9-RuBP

              1.4 ml×2

              -20℃

              常溫

              PU1060-10

              試劑10-酶溶解緩沖液

              5 ml

              -20℃

              常溫

              DE005

              試劑11-滅菌水

              100 ml

              4℃

              常溫

              BSA-02

              試劑12-BSA溶液 50mg/ml

              5 ml

              -20

              常溫

              DT0140P

              試劑13-1MDTT100×)

              1 ml×2

              -20

              常溫

              PC2030-01

              蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×)

              1 ml

              -20

              常溫

              ●     產品簡介:

              核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調節酶,是植物中最豐富的蛋白質,主要存在于葉綠體的可溶部分,總量約占葉綠體可溶蛋白50%~60%。

              這里1分子CO2被固定,就有2分子 NADH 被氧化。因此,由NADH氧化的量就可計算Rubisco的活性,由340nm吸光度的變化可計算NADH氧化的量。

              為了使NADH的氧化與CO2的固定同步,需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統。

               按照1 ml 反應體系計算,該試劑盒可以測定80-100個樣品。

              自備材料:

              植物材料;剪刀;液氮;研缽或其他研磨設備;1.5ml離心管;1ml石英比色皿;紫外分光光度計;制冰機;低溫離心機

              操作步驟:

              一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制:

               

              一個反應配制體積

              n個反應配制體積

               

              1 ml

              n×1 ml

              Rubisco提取緩沖液(

              0.5 ml

              n×0.5 ml

              滅菌水

              470 μl

              n×470 μl

              1 M DTT100×

              10 μl

              n×10 μl

              BSA溶液50mg/ml

              20 μl

              n×20μl

              蛋白酶抑制劑(100×

              10 μl

              n×10μl

              注:1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現配現用,短期4中可以過夜保存。

              2. 為增強Rubisco的穩定性,提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑(CatPC2030

              、 Rubisco樣品提。

              1. 取新鮮植物組織,清洗干凈,擦干,液氮中研磨,1 cm2葉片(1分硬幣大。┗0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液,顛倒混勻,冰浴放置5-10分鐘。

              2.12000g4離心 10分鐘,上清即為Rubisco樣品提取液,常溫放置備用(不要冰浴或4℃放置,常溫放置可以保持Rubisco活性)。

              注:Rubisco樣品提取液最好立即測定,不建議保存。

              、 Rubisco活性測定分析

                 1. 即用型酶溶解緩沖液配制:

                    按照標簽所示,在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液,冰浴備用,-20℃保存。

              2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液,混勻溶解后冰浴備用,-20℃保存。

                 3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液,4℃12000g離心5分鐘,去除上清(小心去除,可以保留少許上清,不要吸棄沉淀),沉淀中按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液,混勻溶解后冰浴備用,-20℃保存。

              4. 試劑9-RuBP:按照標簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

              注:RuBP溶液穩定性較差,用后-20℃保存,有效期3-4天,長期-80℃保存。

              5. 試劑8-NADH:按照標簽所示加入滅菌水,徹底混勻后冰浴備用。

              注:NADH穩定性較差,用后-20℃貯存3-4天,長期-80℃保存。

              6. 反應體系MasterMix配制:

              加入順序

              組份

              1ml反應體系加入量

              MasterMix配制

              (測定n個樣品為例)

              1

              10×Assay Buffer

              100 μl

              n×100μl

              2

              滅菌水

              795μl

              n×795μl

              3

              ATP溶液(100×

              10 μl

              n×10μl

              4

              CrP溶液(100×

              10 μl

              n×10 μl

              5

              GAPDH溶液(200×

              5 μl

              n×5 μl

              6

              PGK溶液(100×

              10 μl

              n×10 μl

              7

              CPK溶液(100×

              10 μl

              n×10 μl

              8

              NADH溶液(100×

              10 μl

              n×10 μl

              7. 反應體系測定;

              1.5 ml離心管中配制以下反應。

               

              1

              2

              3

               

              對照反應

              初始活性測定

              總活性測定

              MasterMix

              950 μl

              950 μl

              950 μl

              即用型Rubisco提取緩沖液

              (步驟一)

              25 μl

              -

              -

              Rubisco樣品提取液

              (步驟二)

              -

              25μl

              25μl

              常溫放置15分鐘

              試劑9-RuBP溶液

              25 μl

              25 μl

              25μl

               

               

              加入RuBP后立即測定OD340讀數,記錄60秒內OD340值變化。

              注:一般分光光度計OD340讀數在0.5-3之間數據比較準確,低于此范圍說明提取用的材料太少,Rubisco活性太低;高于此范圍說明所用材料太多,Rubisco活性太高,此時可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測定。

              、Rubisco活性計算:

              根據如下公式計算樣品中Rubisco活初始性和總活性:

              Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化

              △A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值

              N-稀釋倍數,本程序中為40(1 ml提取液,取25μl測定)。

              6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數

              d-cm 比色皿光程,一般為1

              t-秒 測定時間,本程序為60秒

              S-cm2 提取時使用的葉面積



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