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            RTU4092植物原生質體轉化試劑盒
             產品貨號: RTU4092
             產品名稱: RTU4092植物原生質體轉化試劑盒
             產品價格/規格: 40次 400元
             產品說明書: 暫無
             更新時間: 2022-06-07
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              貨號

              名稱

              包裝

              RTU4092

              植物原生質體轉化試劑盒

              40

               

              ●  產品組成:

              序號

              組分貨號

              名稱

              規格

              貯存

              運輸

              1

              RTU4092-01

              轉化終止溶液

              50 ml

              -20℃

              RT

              2

              RTU4092-02

              轉化試劑

              5 ml

              -20

              RT

              3

              RTU4092-03

              培養溶液

              50 ml

              -20

              RT

              4

               

              說明書

              一份

               

               

              產品簡介:

              植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型,是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源,同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。植物原生質體轉化試劑盒(Plant Protoplasts Transformation Kit)采用的是聚乙二醇轉化方法,借助聚乙二醇短時間內對原生質體產生的沖擊效應,使質粒DNA、RNA或蛋白得以進入原生質體,經轉化的植物原生質體經過一定時間培養后,可用于檢測外源基因的表達和功能,轉化后基因敲除或基因編輯效果等。

              對于擬南芥原生質體,使用本試劑盒轉化質粒后通常2-6小時可以檢測相關基因的轉錄變化(mRNARNA的變化),通常2-16小時后可以檢測到相關蛋白表達的變化,通常24小時可以檢測到基因編輯的效果。

              本試劑盒可以用于相當于6孔板40個孔的樣品,12孔板20個孔的樣品,或24孔板40個孔的樣品的轉化。

              本試劑盒不含有原生質體制備試劑,需要制備原生質體請參見植物原生質體制備試劑盒(RTU4082 )。

              貯存和效期:

                 按照溫度貯存,有效期一年。轉化試劑現用現配。

              試劑盒常溫運輸。

              使用說明:

                 需要準備的材料(試劑盒不提供):

                 平頭鑷子;一次性刀片;50ml離心管;1.5ml離心管;水浴鍋

               一、原生質體轉化步驟:

              1. 轉化溶液配制:

              植物原生質體轉化參考下表根據樣品量配制轉化溶液。

              轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制,以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有較好的轉化效率,但和當天配制的轉化溶液相比,轉化效果可能會有一定程度的下降。

               

              120 μl

              1個樣品)

              1.2 ml

              10個樣品)

              5 ml

              (40個樣品)

              轉化試劑粉末

              48 mg

              480 mg

              2 g

              轉化試劑溶解液(

              60 μl

              0.6 ml

              2.5 ml

              滅菌水

              定容至120 μl

              定容至1.2 ml

              定容至5 ml

              2. 準備質粒:

              取10 μl質粒DNA(10-20 μg,濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。

              注:質粒大小建議為5-10 kb,質粒濃度為1-2 μg/μl左右;原生質體轉化對于質粒的純度要求較高,盡量使用高純度的質粒。多個質粒同時轉化時的體積和總質量保持不變。多個質粒轉化時,每種質粒的用量比例,需要酌情自行調整。質粒轉化也可以在12或24孔板中進行,轉化體系也可以按照比例放大或縮小。本試劑盒中描述的用量相當于是6孔板中的用量。原生質體用多孔板培養時,最好選擇未經表面處理的多孔板。對于經過表面處理的動物細胞培養用多孔板,可以使用5%胎牛血清或小牛血清處理孔表面數秒,這樣有助于減小孔底表面對于原生質體的損傷。

              3. 質粒轉化:

              3.1 質粒管中加入100 μl原生質體溶液(原生質體密度為2×105/ml,約2萬個原生質體),輕柔混勻。

              3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事先準備好的轉化溶液,輕彈管底,輕柔混勻,常溫25℃放置5-15分鐘。

              注:最長可以孵育15 min,但通常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質體和不同的質粒需要通過實驗摸索。

              4. 終止轉化:

              加入2倍體積轉化終止溶液即440 μl,輕柔徹底混勻,終止轉化過程。

              5. 收集原生質體:

              常溫100g離心1-2分鐘,盡量去除上清。

              注:由于轉化后的溶液會非常粘稠,加入轉化終止溶液后離心1 min通?梢允乖|體聚集在管底,但使用某些突變體時為減少原生質體損失,可將離心時間延長到2 min。為了避免原生質體離心時貼在管壁,建議整個實驗過程使用水平轉頭;離心時,可調低離心機的升速和降速。升速過快,原生質體可能離到管壁上;降速過快,可能導致管底原生質體懸起。建議升速和降速分別都使用3。

              6. 原生質體漂洗:

                加入500 μl 轉化終止溶液輕輕重懸原生質體,常溫100g離心1 min,盡量去除殘留的上清。

              注:本步驟可以充分去除殘留的轉化試劑溶液中的組分,避免轉化試劑溶液中的組分對于后續的不良影響。

              7. 原生質體重懸:

              沉淀中加入1 ml培養溶液,輕柔重懸。

              8. 原生質體培養:

              將離心管水平放置,23-25oC弱光培養。

              注:根據實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時;酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時;基因編輯的效果在轉化24小時后可能被檢測到。


               

                                                 使用植物原生質體轉化試劑盒轉化擬南芥原生質體的效果圖。

              實驗步驟:稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離心管中,加入轉化試劑溶解液后,顛倒混勻,蒸餾水定容至2 ml,使轉化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl(20 μg)EGFP質粒 (植物用綠色熒光蛋白),加入100 μl制備好的原生質體,輕柔混勻后加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液,輕柔混勻,常溫靜置5 min后加入440 μl轉化終止溶液終止轉化,輕輕顛倒混勻,常溫100 g離心1 min,去除上清,再加入0.5 ml 轉化終止溶液,輕柔重懸原生質體,常溫100 g離心1 min后,盡量去除上清,收集原生質體。加入1 ml培養溶液,小心重懸原生質體后水平放置25℃培養過夜(約16h),次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。

               


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