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            ·PCR
             
             





            RTG2403 土壤基因組DNA提取試劑盒
             產品貨號: RTG2403
             產品名稱: RTG2403 土壤基因組DNA提取試劑盒
             產品價格/規格: 50次 700元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-06-07
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            • 土壤基因組DNA提取試劑盒目錄號:RTG2403)      

              試劑盒內容及保存:

              試劑盒組成

              RTG2403

              50次)

              貯存方式

              緩沖液R1

              40 ml

              常溫

              緩沖液R2

              6 ml

              常溫

              緩沖液R3

              6 ml

              常溫

              緩沖液R4

              10 ml

              常溫

              緩沖液 R5(濃縮液)

              15 ml

              常溫

              漂洗緩沖液WB1

              30 ml

              常溫

              漂洗緩沖液PW (濃縮液)

              13 ml

              常溫

              洗脫緩沖液EB

              15 ml

              常溫

              Glass beads

              20 g

              常溫

              吸附柱CG

              50

              常溫

              收集管(2 ml

              50

              常溫

              說明書

              1

               

               

              儲存條件和效期:

              本試劑盒在室溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年。緩沖液R2和R3可能有沉淀產生,若溶液產生沉淀,應在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。

              產品簡介:

              土壤樣品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金屬離子等,而純化的DNA 中只要有這些微量物質的存在,都會影響到PCR等酶促反應。本公司的土壤試劑盒采用獨特的腐殖酸去除液(緩沖液R2)能夠有效去除腐殖酸;吸附柱CG能能有效去除金屬等抑制因子,提純得到的基因組DNA可直接用于PCR 反應,酶切或定量實驗。

              準備工作:

              1. 準備55℃,70℃水;無水乙醇;異丙醇;制冰機;1.5ml離心管;2ml離心管

              2. 按照標簽所示在漂洗緩沖液PW中加入無水乙醇;緩沖液R5中加入異丙醇,混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存備用。

              3. 每次使用前請檢查緩沖液R2,緩沖液R3是否有沉淀生成,如果出現沉淀,37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

              標準操作步驟:

              如非指出,所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

              1. 0.3-0.5 g土壤置于2ml離心管中,加入0.4 g Glass Beads,再加入700 μl 緩沖液R1100 μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5min。

              注意:對含水量豐富的樣品,可以預先離心除去部分水分后再稱取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去除劑,100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤, 緩沖液R2的量可以適當增加,但不能超過250μl,否則會嚴重影響DNA的得率。

              2. 加入100 μl 緩沖液R3R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用),渦旋混勻。 70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。

                 注意:如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA,請在70℃處理完后,再90℃水浴處理2min。

              3. 12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘,取600μl上清到1.5ml離心管中,加入180 μl 緩沖液R4混勻。

              注:轉移上清時確保不要吸取到沉淀,轉移的上清量最好不超過80%。

              4. 冰上放置5分鐘。12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘。 轉移上清到新的1.5ml離心管中。

              注:轉移上清時確保不要吸取到沉淀,轉移的上清量最好不超過80%。

              5. 加入與上清等體積的緩沖液R5(使用前請檢查是否已加入異丙醇),顛倒混勻。

              6. 750 μl混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000 rpm(~13,000g)離心30秒,倒掉濾出液。

              7. 將剩余的混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(~13,000g)離心30秒,倒掉濾過液。

              8. 向吸附柱CG中加入500μl 漂洗緩沖液WB1,12,000 rpm (~13,000×g )  離心30 秒,倒掉廢液。

              9. 向吸附柱CG中加入600μl 漂洗緩沖液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000 rpm (~13,000g) 離心30 秒,倒掉廢液,吸附柱CG放入收集管中。

              10. 向吸附柱CG中加入600μl漂洗緩沖液PW,12,000 rpm (~13,000g) 離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱CG放入收集管中。

              11. 12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

              :此步驟非常重要,其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR等)實驗。

              12. 將吸附柱CG轉入一個干凈的1.5ml離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl70水浴預熱的洗脫緩沖液EB,室溫放置2分鐘,12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘。

              ; = 1 \* GB3 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl,體積過小影響回收效率。

              = 2 \* GB3 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內,pH值低于7.0會降低洗脫效率。

              13. DNA產物-20保存。

               

              大量操作步驟(針對含微量核酸的樣品)

              1. 1-5g土壤置于10ml離心管中,加入1g Glass Beads,再加入3ml 緩沖液R1200μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5分鐘。

              2. 加入600μl 緩沖液R3,渦旋混勻。70水浴處理10分鐘。期間振蕩幾次。

              3.3000g離心3分鐘,轉移上清到新的離心管中,加入550μl 緩沖液R4混勻。

              4. 冰上放置5分鐘。8000g離心10分鐘。轉移上清到新的離心管中。

              5. 以下按標準操作步驟的第五步繼續操作。

               

              DNA濃度及純度檢測:

              基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度?膳渲0.8-1.0%瓊脂糖凝膠,使用λ/HindIII判斷基因組的大小,完整的基因組大小應在23kb以上。使用分光光度計檢測時, OD260/OD280比值應為1.7–1.9之間,如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水洗脫,比值可能偏低,但并不表明DNA純度不高。


               

               

               

               

               

              常見問題分析:

               

              常見問題

              可能原因

              建議

              沒有洗脫出DNA

              緩沖液R5沒有加入異丙醇

              樣品過柱前,必須用異丙醇調整核酸結合條件,否則核酸不能掛柱。

              漂洗緩沖液PW中沒有加入乙醇

              漂洗緩沖液PW使用前請按照標簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正確會導致核酸提取量大大降低。

              低濃度的DNA

              緩沖液R2使用過量

              按照步驟1加入適量緩沖液R2

              洗脫體積太小

              洗脫體積不能低于50μl,如洗脫體積太小,回收率將大大降低。

              洗滌不恰當

              漂洗緩沖液PW使用前請按照標簽加入無水乙醇。無水乙醇加入量不正確會導致核酸提取量大大降低。

              A260/A280比率

              蛋白污染

              不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱

              洗脫液pH值不合適

              確保使用的洗脫液pH8.0以上,如低于8.0將導致DNA洗脫量過低。

              下游應用不好

              提取的DNA含鹽量高

              漂洗緩沖液PW使用前請按照標簽加入無水乙醇。

              提取的DNA含有乙醇

              步驟11空甩柱子2分鐘非常關鍵,徹底去除漂洗液中的乙醇。

              抑制PCR反應

              增加緩沖液R2用量,徹底去除腐殖酸等PCR抑制因子;步驟4中確保不要吸取到沉淀。

               



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