土壤基因組DNA提取試劑盒（目錄號：RTG2403）      

● 試劑盒內容及保存：

● 儲存條件和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。緩沖液R2和R3可能有沉淀產生，若溶液產生沉淀，應在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。

● 產品簡介：

土壤樣品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金屬離子等，而純化的DNA 中只要有這些微量物質的存在，都會影響到PCR等酶促反應。本公司的土壤試劑盒采用獨特的腐殖酸去除液（緩沖液R2）能夠有效去除腐殖酸；吸附柱CG能能有效去除金屬等抑制因子，提純得到的基因組DNA可直接用于PCR 反應，酶切或定量實驗。

● 準備工作：

1. 準備55℃，70℃水��；無水乙醇；異丙醇；制冰機；1.5ml離心管；2ml離心管

2. 按照標簽所示在漂洗緩沖液PW中加入無水乙醇；緩沖液R5中加入異丙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存備用。

3. 每次使用前請檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉淀生成，如果出現沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 標準操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1. 稱0.3-0.5 g土壤置于2ml離心管中，加入0.4 g Glass Beads，再加入700 μl 緩沖液R1與100 μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意：對含水量豐富的樣品，可以預先離心除去部分水分后再稱取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去除劑，100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， 緩沖液R2的量可以適當增加，但不能超過250μl，否則會嚴重影響DNA的得率。

2. 加入100 μl 緩沖液R3（R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋混勻。 70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。

   注意：如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA，請在70℃處理完后，再90℃水浴處理2min。

3. 12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘，取600μl上清到1.5ml離心管中，加入180 μl 緩沖液R4混勻。

注：轉移上清時確保不要吸取到沉淀，轉移的上清量最好不超過80%。

4. 冰上放置5分鐘。12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘。 轉移上清到新的1.5ml離心管中。

注：轉移上清時確保不要吸取到沉淀，轉移的上清量最好不超過80%。

5. 加入與上清等體積的緩沖液R5（使用前請檢查是否已加入異丙醇），顛倒混勻。

6. 取750 μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉濾出液。

7. 將剩余的混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉濾過液。

8. 向吸附柱CG中加入500μl 漂洗緩沖液WB1，12,000 rpm (~13,000×g )  離心30 秒，倒掉廢液。

9. 向吸附柱CG中加入600μl 漂洗緩沖液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000 rpm (~13,000g) 離心30 秒，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入600μl漂洗緩沖液PW，12,000 rpm (~13,000g) 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CG放入收集管中。

11. 12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

注：此步驟非常重要，其目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

12. 將吸附柱CG轉入一個干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經70℃水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘。

注； = 1 \* GB3 ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過小影響回收效率。

= 2 \* GB3 ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

13. DNA產物-20℃保存。

大量操作步驟（針對含微量核酸的樣品）

1. 稱1-5g土壤置于10ml離心管中，加入1g Glass Beads，再加入3ml 緩沖液R1與200μl 緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5分鐘。

2. 加入600μl 緩沖液R3，渦旋混勻。70℃水浴處理10分鐘。期間振蕩幾次。

3.3000g離心3分鐘，轉移上清到新的離心管中，加入550μl 緩沖液R4混勻。

4. 冰上放置5分鐘。8000g離心10分鐘。轉移上清到新的離心管中。

5. 以下按標準操作步驟的第五步繼續操作。

● DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度�？膳渲�0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應在23kb以上。使用分光光度計檢測時， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應為1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。

● 常見問題分析：