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            RIPA裂解液(強)
             產品貨號: RL1020
             產品名稱: RIPA裂解液(強)
             產品價格/規格: 100 ml/200元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-06-07
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              產品包裝:

              產品編號

              產品名稱

              產品包裝

              說明書

              RL0120

              RIPA裂解液()

              100 ml

              1

              產品簡介:

              RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio  Immunoprecipitation  Assay。RIPA裂解液的配方有很多種,根據其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類。RIPA裂解液(強)的主要成分為50 mM Tris (pH 7.4),150 mM NaCl,1% Triton X-100,1% sodium deoxycholate,0.1% SDS,以及sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多種抑制劑?梢杂行б种频鞍捉到。用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品,可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑,不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

              保存條件:

              -20℃保存,一年有效。

              注意事項:

              1.為取得最佳的使用效果,盡量避免過多的反復凍融?梢赃m當分裝后使用。需自備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。

              2. RIPA裂解液的裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物,屬正,F象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測與基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續實驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子,例如NF-kappaB、p53等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉錄因子。

              使用說明:

              1.  準備RIPA裂解液:

              融解RIPA裂解液,混勻;取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入1/100體積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度為1 mM。

              2. 細胞蛋白提。

              2.1 貼壁細胞:去除培養液,加入適量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸,冰上裂解細胞5分鐘,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離心管中,冰上繼續裂解15分鐘,間歇混勻。

              培養板規格/培養皿表面積

              細胞量

              RIPA推薦使用量

              100 mm培養皿

              1.5×107

              0.5-1 ml

              60 mm培養皿

              5×106

              0.25-0.5 ml

              35 mm培養皿

              2×106

              0.2-0.4 ml

              6孔板

              2.5×106

              100-200 μl

              24孔板

              5×105

              100-150 μl

              96孔板

              1×105

              50-100 μl

              2.2 懸浮細胞:450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;用適量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重復漂洗細胞一次;按照細胞沉淀體積(PCM)20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA,混勻細胞沉淀,冰浴處理15分鐘,間歇混勻。

              注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉淀體積(PCM,Packed Cell Volume)大約為20 μl。

              2.3 充分裂解后,16000 g離心10分鐘,取上清,即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

              注:裂解中細胞會釋放出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,離心前可以用吸頭挑出丟棄。

              3. 組織樣品蛋白提。

              3.1 手術切除的組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數次,洗凈組織血跡,用濾紙吸

              干組織表面液體,將組織切成細小的碎片。

              3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)

              3.3 用玻璃勻漿器勻漿或者使用27#針頭抽提5-10次,直至充分裂解。

              3.4 充分裂解后,16000 g離心10分鐘,取上清,即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

              實驗示例:

              Jurkat RIPA總蛋白提取,GAPDH檢測

              總蛋白提。4×106 Jurkat細胞,450 g 離心收集,去上清,PBS漂洗兩次,沉淀中加入200 μl RIPA(加2 μl 100 mM PMSF),冰上裂解5分鐘,4℃ 16000 g 15 分鐘,上清即為總蛋白(TP)。

              電泳:RTD6132-15%3.3C  200 V 33-12 mA 55 min

              轉膜:NC膜,1×RealBlot快速轉膜液濕轉,穩流400 mA,電壓變化64-57 V,轉膜時間35 min

              封閉:無蛋白快速封閉液,RT 20 min

              一抗孵育:GAPDH 羊抗兔多抗,一抗稀釋液稀釋1:2000

              二抗孵育:羊抗兔IgG-HRP,二抗稀釋液稀釋1:5000

              檢測:ECL發光檢測



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