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            RTR2306 RealPure動物組織/細胞RNA提取試劑盒
             產品貨號: RTR2306
             產品名稱: RTR2306 RealPure動物組織/細胞RNA提取試劑盒
             產品價格/規格: 50次 600元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-06-07
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            • RealPure Animal Tissues/Cell RNA Extraction Kit

              RealPure動物組織/細胞RNA提取試劑盒

              試劑盒內容及保存:

              試劑盒組成

              RTR2306-01

              50次)

              貯存方式

              裂解液RL

              30 ml

              常溫

              去蛋白液RD

              30 ml

              常溫

              漂洗液RW(濃縮液)

              25 ml

              首次使用按照標簽加入無水乙醇

              常溫

              RNase-free

              5 ml

              4

              DNA清除柱CSRNase-free

              50

              常溫

              RNA吸附柱CRRNase-free

              50

              常溫

              收集管

              100

              常溫

              2 ml離心管(RNase-free

              50

              常溫

              1.5 ml離心管(RNase-free

              150

              常溫

              說明書

              1

               

              儲存條件和效期:

              RNase-free水4℃貯存;其他試劑在常溫(25℃左右)干燥條件下,可保存1年。試劑盒常溫運輸。

              產品簡介:

              本試劑盒可從動物組織中快速提取總RNA, 可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高,沒有蛋白和其它雜質的污染,可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

              準備工作:

              1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%,如1 ml RL中加入10 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

              2 按照標簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇(自備),混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存備用。

              3 所有離心步驟均在常溫下進行。


               

              操作步驟:

              1. 樣品處理和裂解:

              1.1 貼壁細胞:

              1.1.1直接裂解法:

              不需胰酶消化,徹底吸干凈培養液體后直接加推薦量裂解液 RL(使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇)(下表)反復吹打細胞裂解,可以漩渦震蕩,直到看不到細胞團為止,進行步驟2。

              培養器皿

              底面積(cm2

              加培養液量 ml

              可獲細胞量

              裂解液RL加入體積

              24孔培養板

              2

              1

              5×106

              350 μl

              3.5cm培養皿

              8

              3

              2×106

              350 μl

              6孔培養板

              9.6

              2.5

              2.5×106

              600 μl

              6cm培養皿

              21

              5

              5.2×106

              600 μl

              25cm培養皿

              25

              5

              5.2×106

              600 μl

              100ml玻璃培養瓶

              33

              10

              7×106

              600 μl

              1.1. 2 胰蛋白酶消化法:

              確定細胞數量(收集細胞數量請不要超過1×107),吸除培養基,用PBS洗滌細胞,吸除PBS,向細胞中加入胰酶消化液處理細胞,當細胞脫離容器壁時,加入含有血清的培養基失活胰蛋白酶,將細胞溶液轉移至1.5 ml離心管中,300×g離心5 min,收集細胞沉淀,仔細吸除所有上清,加 350 μl(<5x106細胞)或 600 μl(5x106-1x107細胞)裂解液 RL(使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇),反復吹打細胞裂解,可以漩渦震蕩,直到看不到細胞團為止,進行步驟2。

              1.2 懸浮細胞:

              300×g離心 5 min收集懸浮細胞(收集細胞數量請不要超過1×107)到一個1.5ml 離心管中,完全吸棄上清,加 350 μl(<5x106細胞)或 600 μl(5x106-1x107細胞)裂解液 RL(使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇),反復吹打細胞裂解,可以漩渦震蕩,直到看不到細胞團為止,進行步驟2。

                 1.3 動物組織:

                     新鮮組織加入350 μl(<20mg 組織)或者 600 μl(20-30mg 組織)的裂解液RL(使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇)后玻璃勻漿器或電動勻漿器將組織徹底研磨勻漿,進行步驟2。

              注意:組織量一定不要超過30 mg,否則將導致RNA得率和質量下降。

              背景知識:樣品處理量絕對不要超過DNA/RNA吸附柱處理能力,否則造成DNA/RNA殘留或者產量降低。不同組織細胞種類DNA/RNA相差極大,例如胸腺脾臟DNA含量豐富,超過5 mg就會超過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富,超過3x106細胞就會超過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時,如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量,如細胞不超過3-4x106,組織不超過10mg,隨后根據實驗結果增加或者減少處理量。

              2. 離心得到上清:

              若沒有不溶性沉淀,直接進行步驟3。如有不能裂解的碎片或者不溶物,13,000 rpm離心5 min, 取裂解物上清進行下一步。

              3. 去除基因組污染和洗脫RNA

              將DNA清除柱CS放入一干凈的2 ml離心管內,用移液器小心將步驟2離心管內的溶液或離心后的上清全部轉移到DNA清除柱CS中,13,000 rpm離心2分鐘RNA在離心管濾液中,不要丟棄)。

              注:確保全部溶液都收集到2 ml離心管中,如果膜上有殘留液體,延長離心時間至5分鐘,保證膜上無殘留液體。

              4. RNA掛柱:

                向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水乙醇(如濾液體積為300 μl/600 μl,加入150 μl/300 μl無水乙醇),此時可能會出現沉淀,立即混勻,不要離心。將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中),13,000 rpm離心1分鐘。

              注:確保溶液全部過濾到收集管中,膜上無殘留,如有必要,可以延長離心時間至5分鐘。

              5. 去除RNA中的蛋白污染:

              向RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl 去蛋白液RD,13,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。

              6. 去除RNA中的其他雜質:

              向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW(使用前請先檢查是否已加入乙醇), 13,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。

              7. 進一步去除RNA中的其他雜質:

              向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW (使用前請先檢查是否已加入乙醇),13,000 rpm離心1

              分鐘,棄廢液。

              8.  關鍵步驟:徹底去除吸附柱上的殘余乙醇:

              將吸附柱CR放回收集管中,確保蓋好吸附柱管蓋,13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘,去除吸附柱上的殘余液體。

              注:此步驟目的是將吸附柱中殘余漂洗液去除,如果有漂洗液殘留,可能會影響后續的RT等實驗操作。

              9. 洗脫得到RNA

              將RNA吸附柱CR轉入一個新的1.5 ml RNase-free離心管中,向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(事先65℃預熱可提高洗脫效率),蓋好吸附柱管蓋,常溫放置2分鐘,13,000 rpm離心2 分鐘。

              注:確保水要加到膜的中央,不要貼壁加入;洗脫緩沖液體積不應少于50 μl,體積過小影響回收效率。

              10.  RNA貯存:

              RNA樣品-80℃中保存。

              RNA產量和質量的評估:

              1. RNA產量:

              用分光光度計測定OD260的吸光值來計算RNA產量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液(10mMTris pH8.0,1mMEDTA)中,根據以下公式計算:

              A260×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

              注:測定OD值時,盡量不要用RNase-free水稀釋RNA,因為RNase-free水pH較低,測定的OD值偏低。

              2. RNA質量:

              凝膠電泳檢測:凝膠電泳中,動物的完整RNA應該有兩條主帶:28S和18S,并且28S亮度應該與18S相當或是其亮度的2倍?梢允褂闷胀ǖ1×TAE瓊脂糖凝膠電泳,凝膠濃度1-1.5 %,可以使用高電壓,短時間電泳,如7V/cm電泳,20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder(Cat:RTM415)作為Marker。28S rRNA遷移率與1800bp類似,18S rRNA遷移率與1000bp類似。

              吸光值檢測:可以用A230,A260和A280的數值表示RNA的純度。純凈的RNA的 A260/A280比值應該為2,我們得到的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間,如果比值低于1.8,表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴重。A260/A230比值應該在2-2.2之間。如果此比值低于2,表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

              ●  實驗示例:

               

              問題指南:

              1. 離心柱發生堵塞

              離心柱發生堵塞之后會造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。

              常見原因分析如下:

              1.1組織或細胞破碎不徹底。

              破碎不徹底會使吸附柱發生堵塞,同時會影響 RNA 得率及質量。我們建議在進行裂解時,盡量借助輔助手段如機械勻漿徹底破碎組織。

              1.2 樣本初始量過多。

              樣本使用量過多會導致裂解液RL裂解細胞時不完全,導致離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初始最大量107細胞或30 mg組織。

              1.3 離心機的溫度過低。

              整個 RNA 分離純化所有的步驟均在常溫(20-25)進行。有些低溫離心機的溫度低于 20,可能會造成離心柱的堵塞。如果發生這種現象,請將離心機溫度設置到 20-25。

              2. 提取不到RNA或者RNA產量低

              通常會有多種因素影響回收效率,比如:樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

              常見原因分析:

              2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導致RNA 已經降解。

              建議:新采集的樣本應立即放入液氮中速凍,長期保存于-70并避免樣本的反復凍融;或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

              2.2  樣本破碎裂解不充分導致純化柱堵塞。

              建議:參見1。

              2.3  洗脫液添加不正確。

              建議:確認 RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

              2.4  漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。

              建議:請按照說明書,在試劑盒使用前,漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。

              2.5  組織樣本用量不合適。

              建議:每 600 μl 裂解液RL使用最大細胞量為1×107,使用最大組織量為30 mg,過多會導致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 純度也會降低。我們強烈建議每單次 RNA提取操作,樣本初始用量一定不要超過最大建議量。

              2.6  洗脫體積不合適或洗脫不徹底。

              建議:純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl;若洗脫效果并不理想,建議在加入65預熱的RNase-Free 水后,延長常溫放置的時間,例如放置 5-10 min。

              2.7  純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇殘留。

              建議:漂洗液RW洗滌后,吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟,以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。

              3. 純化獲得的RNA有降解

              純化得到的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。

              常見原因分析:

              3.1  組織樣本采集后沒有及時保存。

              建議:組織樣本在收集后若不及時使用,請立即低溫保存于液氮中或經液氮速凍后立即轉移至-70

              長期保存,或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

              3.2  組織樣本反復凍融。

              建議:組織樣本保存時,最好分裝成小份,使用時取出其中一份即可,避免樣本的反復凍融導致 RNA 的降解。

              3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

              建議:RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行,并在實驗前清理好實驗桌,實驗時佩戴一次性手套、口罩,最大程度上避免 RNase 引入導致的RNA 降解。

              3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

              建議:更換新的提取試劑盒進行相關實驗。

              3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

              建議:確認 RNA 提取時所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。

              4. RNA中含有DNA污染

              4.1 提取的起始材料量超過最大建議量

              建議:步驟1-樣品處理時使用107細胞或30 mg組織,不要超過最大處理量,否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理極限,導致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

              4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

              建議:步驟3-去除基因組污染步驟必不可少,不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組 DNA,使用裂解液RL洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

              4.3  跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟(見操作步驟第5步)。

              建議:這一步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜質蛋白十分重要,一定不能省略,否則將會導致純化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

              5. 純化獲得的RNA影響下游實驗

              經吸附柱純化的 RNA,如果鹽離子、蛋白質含量過多會影響下游實驗,比如:逆轉錄、Northern Blot 等。

              1.  洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。

              建議:確認漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇,并按操作說明的離心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 (見操作步驟第6,7步)。

              2.  洗脫后的 RNA 有乙醇殘留。

              建議:確認 RW第二次洗滌后,按操作說明的對吸附柱進行空管離心操作(見操作步驟第8 步),如果還有乙醇殘留,可以將空管離心后吸附柱開蓋常溫放置 5 min,以最大程

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