RealPure Plant RNA Extraction Kit

（for containing high polysaccharide and polyphenol components）

RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒

● 試劑盒內容及保存：

● 儲存條件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運輸。

● 產品簡介：

本試劑盒可從植物葉片、莖、幼苗、果肉中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除植物中的多糖多酚對RNA提取的影響。20-30分鐘內即可完成反應，提取的總RNA純度高，沒有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等實驗。

該試劑盒不能有效提取植物種子、塊莖、鱗莖的RNA，提取這些材料的RNA請選擇RealPure植物種子RNA提取試劑盒（Cat：RTR2308）。

● 準備工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照標簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存備用。

3 所有離心步驟均在常溫下進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml離心管中加入500 μl裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），50 μl緩沖液PRS混勻備用。

注：多糖多酚植物（如銀杏，毛白楊等）加入RL后，要加入緩沖液PRS，普通植物（如擬南芥，小麥，水稻，煙草）可以不加緩沖液PRS。如果不能判斷植物是否為多糖多酚植物，請加入緩沖液PRS。

注：快速判斷是否為多糖多酚植物：

取20mg左右的植物材料，放入1.5 ml離心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分鐘，觀察裂解物顏色。顏色為綠色或淡黃色為普通植物；顏色為棕黃色或棕紅色為多糖多酚植物。

1.2將植物材料加入到液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，常溫放置5分鐘。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RL的裂解能力會導致RNA提取失敗。

2. 離心取上清：

13,000 rpm離心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。一般可獲得400 μl上清。

3. 去除基因組污染：

上清中加入0.5倍體積的無水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時可能會出現沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鐘，棄掉收集管中的廢液。

注：確保全部溶液都收集到收集管中，如果膜上有殘留液體，延長離心時間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. 洗脫RNA：

  將DNA清除柱放入一干凈的2 ml離心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鐘，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丟棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時可能會出現沉淀，立即混勻，不要離心。

5. RNA掛柱：

  將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心2分鐘。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時間至5分鐘。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

8. 進一步去除RNA中的其他雜質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液，將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的RT等實驗操作。

10. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉入一個新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小影響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產量和質量的評估：

1. RNA產量：

用分光光度計測定OD₂₆₀的吸光值來計算RNA產量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下公式計算：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因為RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，完整的RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相當或是其亮度的2倍�？梢允褂闷胀ǖ�1×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高電壓，短時間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。植物28S rRNA遷移率與1500bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。