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            RTD8201 His標簽蛋白純化試劑盒
             產品貨號: RTD8201
             產品名稱: RTD8201 His標簽蛋白純化試劑盒
             產品價格/規格: 20次 500元
             產品說明書: 暫無
             更新時間: 2022-04-22
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            • His標簽蛋白純化試劑盒

              產品編號

              產品名稱

              包裝

              RTD8201

              His標簽蛋白純化試劑盒

              20

              產品簡介:

              His標簽蛋白純化試劑盒(His-tag Protein Purification Kit)也稱為鎳柱試劑盒,采用NTA His-tag 純化樹脂可以兼容高濃度變性劑(8M尿素或6M鹽酸胍),能夠簡單、快速、靈活、高效并且高特異性地在非變性或變性條件下純化His標簽蛋白。純化原理:通常帶有6個組氨酸標簽的重組蛋白(6X His-tagged recombinant protein)或帶有6個以上連續組氨酸標簽的重組蛋白,被稱為His標簽蛋白。蛋白樣品溶液通過NTA His-tag 純化樹脂時,重組蛋白His標簽上的組氨酸殘基能特異性地結合到樹脂中的鎳離子上,其它蛋白則不能被結合。洗滌后,His標簽重組蛋白被洗脫,從而被分離純化。

              試劑盒配套的NTA His-tag 純化樹脂采用高度交聯的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質,并使用了進一步優化的連接臂和鎳離子螯合技術,非特異性蛋白結合顯著降低,耐受壓力強,鎳離子螯合非常穩定。具體參數如下:

               

              NTA His-tag 純化樹脂參數

              顆粒直徑

              45-165 μm

              最大蛋白結合量

              25-35 mg/ml樹脂

              pH穩定性

              3-12長期

              2-14短期

              貯存溶液

              20%乙醇

              耐受壓力

               

              推薦流速

              0.5 ml/min

              本試劑盒用途廣泛,可以用于在非變性條件和變性條件下純化His標簽蛋白。試劑盒配套有蛋白純化柱,只需通過離心即可完成His標簽蛋白的結合、漂洗及洗脫步驟,方便快捷。

              按照每次收集2 ml細菌沉淀,每次使用50 μl NTA His-tag樹脂純化,參考本說明書本試劑盒足夠進行20次的小量His 標簽蛋白純化。每次蛋白(~55kD)的最大純化量為0.5-1 mg。

              貯存及運輸:

              4-8℃保存,至少一年有效;試劑盒常溫運輸。

              產品組成:

              產品貨號

              產品名稱

              包裝

              貯存

              RTD8201-01

              NTA His-tag純化樹脂

              1 ml

              4-8

              RTD8201-02

              非變性裂解液

              25 ml

              4-8

              RTD8201-03

              非變性漂洗液

              25 ml

              4-8

              RTD8201-04

              非變性洗脫液

              2 ml

              4-8

              RTD8201-05

              溶菌酶 100mg/ml

              0.5 ml

              4-8

              (配制后-20)

              RTD8201-06

              變性裂解液

              25 ml

              4-8

              RTD8201-07

              變性漂洗液

              25 ml

              4-8

              RTD8201-08

              變性洗脫液

              2 ml

              4-8

              HP-50

              蛋白純化柱(含篩板和堵頭)

              20

              RT

              -

              2 ml收集管

              20

              RT

               

              說明書

              -

              -

              使用說明:

              . 大腸桿菌中His標簽重組蛋白的誘導表達:

              1.1 挑取含His標簽重組蛋白的單克隆,接種到10 ml相應抗生素的LB培養液中,培養過夜。

              1.2 按照1:20的比例取培養過夜的菌液,接種到含相應抗生素的LB培養液中。例如取1ml培養過夜的菌液接種到20ml含適當抗生素的LB培養液中。

              1.3 37℃常規培養約30-60 min或更長時間,至菌液的OD600達到0.6。

                 :OD值非常重要,0.6為細菌生長的對數期。

              1.4 加入IPTG至終濃度為0.4-1 mM,適當溫度繼續培養4-5小時。

              注:加入IPTG前留取1 ml菌液作為未誘導的對照。對于特定蛋白的誘導表達,最佳的IPTG濃度、誘導溫度、和誘導時間需要通過實驗確定。

              1.5 2 ml菌液加入到2 ml離心管中,4 13,000 g離心1min,棄上清,收集菌液沉淀。隨后即可進入細菌裂解步驟。

              注:菌液沉淀也可以在-80oC凍存備用。冷凍保存的菌體使用前需置于冰上解凍15 min。

              . His標簽蛋白的小量純化:

              2.1 裂解:

              接步驟1.5,細菌沉淀中加入100 μl 非變性裂解液/變性裂解液,將細菌沉淀充分重懸于裂解液中,可進行輕微的漩渦混勻(盡量避免產生氣泡)。

              a 裂解液的使用量:

              根據His標簽重組蛋白表達的豐度,菌液和裂解液的體積比可以在25:1-5:1范圍內適當調整。表達豐度非常高時,每毫升菌液沉淀可以加入200 μl裂解液;表達豐度非常低時,每毫升菌液沉淀可以加入40 μl裂解液。

              b 非變性裂解液和變性裂解液的選擇:

              多數情況下應優先選擇非變性條件進行目的蛋白的裂解,因為此條件下得到的純化蛋白是有活性的。如果發現非變性條件目的蛋白的裂解效果欠佳,但目的蛋白的表達量能達到預期時,首先宜考慮調整目的蛋白的誘導表達條件,例如調整IPTG等誘導劑的濃度和誘導時的溫度等。如果調整誘導條件后在非變性條件下仍然裂解效果欠佳,此時再考慮選擇變性條件進行裂解、洗滌和洗脫。變性條件下使用尿素作為變性劑,樣品溶解性好,洗脫樣品無需透析可以直接PAGE檢測,最終純化獲得的目的蛋白可以通過透析去除尿素后復性得到有活性的蛋白。

              2.2 可選步驟:

              加入終濃度1 mM PMSF或蛋白酶抑制劑混合物,混勻。

                  注:蛋白酶抑制劑能防止蛋白降解。

              2.3 酶解:

              加入終濃度1 mg/ml溶菌酶并輕輕混勻,盡量避免產生氣泡,冰水浴或冰上放置30min。

              注:溶菌酶根據標簽指示用滅菌水配制成100 mg/ml的母液,現用現加。溶菌酶配制成母液后,可以適當分裝后-20保存。

              2.4超聲:

              冰上超聲裂解細菌。超聲功率200-300 W,每次超聲處理10 s,每次間隔10 s,共超聲處理6-10次。具體超聲處理的方式須根據特定型號的超聲儀器自行摸索和優化。

              注:此步驟非常重要,如果超聲不徹底,His標簽蛋白不能有效釋放,會導致大量目的蛋白在步驟2.5離心后會留在沉淀中,導致蛋白純化效率大大降低。

              2.5 離心得到上清:

              4 13000 rpm 離心10 min,收集上清至1.5ml離心管中,取10 μl上清留樣作后續檢測用。待純化的His標簽蛋白即在上清中。

              2.6 蛋白純化柱裝配:

              2.6.1 蛋白純化空柱(純化空柱放入2 ml收集管中)中加入50 μl NTA His-tag樹脂,旋緊蓋子,擰掉柱子底部的連接。4 2000 rpm 1分鐘,棄收集管內溶液。

              注:轉速不要高于2000 rm,高轉速容易損傷樹脂。

              2.6.2 純化柱中加入500 μl非變性裂解液/變性裂解液,旋緊蓋子,4℃ 2000 rpm 1分鐘,棄收集管內溶液;

              2.6.3 重復2.6.2步驟一次。

              注:此兩個步驟是用緩沖液平衡樹脂,可以有效提高蛋白純化效率。

              2.7 樹脂螯合His標簽蛋白:

              2.7.1將紅色堵頭安裝在純化柱下端突起上,純化柱中加入步驟2.5得到的上清(約80-90 μl),旋緊蓋子。4℃ 搖床搖動30分鐘,使蛋白和樹脂充分結合。

              注:樹脂和蛋白結合可以混合更長時間,可以過夜處理。

              2.7.2 拔掉紅色堵頭,將純化柱放入2 ml收集管中,旋緊蓋子,4℃ 2000 rpm 1分鐘。

              注:建議保留流穿液待檢,檢測樹脂的結合能力。

              2.8 漂洗:

              2.8.1 純化柱內加入500 μl 非變性漂洗液/變性漂洗液,4℃ 2000 rpm 1分鐘,棄收集管內溶液。

              2.8.2 重復2.8.1步驟再次漂洗一次。

              2.9 洗脫:

              2.9.1 將純化柱轉移到一干凈1.5 ml離心管中,加入30-50 μl非變性洗脫液,輕彈混勻,4℃ 2000 rpm 1分鐘,1.5ml離心管內即為純化的目的蛋白;

              2.9.2重復2.9.1再次洗脫一次。

              2.10 收集:

              收集兩次洗脫液即為純化的目的蛋白,-20或-80℃貯存。

              實驗示例:

               


              非變性條件下His-tag蛋白純化

              電泳條件:1×TGS,4-20% RealPAGE Precast Gel 150V 60min

              M1:RTD6105 雙色預染寬分子量蛋白Marker(10-170 kD)

              M2:RTD6111 寬分子量蛋白Marker(10-200 kD)

              未誘導對照(步驟1.4);IPTG誘導對照(步驟1.6 );

                             離心后上清(步驟3.5 );流穿液FT(步驟3.7.2); 

                             漂洗液1 (W1)(步驟3.8.1 );漂洗液2 (W2)(步驟3.8.2 );

                             洗脫液1(E1)(步驟3.9.1); 洗脫液2(E2)(步驟3.9.2)



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