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            ·PCR
             
             
             





            RTQ3101 2×SYBR qPCR MasterMix
             產品貨號: RTQ3101
             產品名稱: RTQ3101 2×SYBR qPCR MasterMix
             產品價格/規格: 1ml 300元/5×1ml 1200元/25×1ml 5000元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-03-22
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            • 2×SYBR qPCR MasterMixUniversal

              產品包裝:

               

               

              組成

              RTQ3101-02

              (可做4050 μl反應)

              RTQ3101-03

              (可做20050 μl反應)

              RTQ3101-04

              (可做100050 μl反應)

              長期貯存

              2×SYBR qPCR MasterMix

              1ml

              5×1ml

              25×1ml

              -20℃

              RNase-free water

              1 ml

              5×1 ml

              25×1 ml

              -20

               

              注:以50μl qPCR反應體系為例,每次使用25 μl 2×MasterMix,1 ml可做40 50μl qPCR反應。

              儲存條件: -20℃避光保存;經常使用時,一旦融化后請4℃貯存,4℃保存至少3個月;盡量避免反復凍融。

              產品簡介:

              本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑。已經將 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一種適合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑,具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點。

              本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶,并結合精心優化的反應 Buffer,從而有效抑制低溫下的非特異性擴增,提高反應特異性和擴增效率,能夠在更寬廣的范圍內進行準確定量。使用時只需加入模板、引物和水,便可在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線,對目的基因進行準確定量檢測,重復性好,可信度高。

              預混液中含有優化的校正染料,與一系列qPCR設備兼容,包括需要ROX校正的儀器,實驗操作過程中不需要額外添加校準染料來校正儀器。

              注意事項

              1. 本制品中已經含有優化的校正染料,客戶無需再添加校正染料,可以直接使用。

              2. 本制品含SYBR® Green I,強光下易分解,使用時避免長時間強光照射本制品。

              3. 建議在冰上配制qPCR反應液,再放入qPCR儀器中擴增?梢蕴岣邤U增特異性,減少背景。

              4.-20℃下保存時間較長,有微量沉淀產生,充分混勻后不影響使用。本制品已經優化了反應緩沖液中的Mg2+濃度,無需再調節Mg2+濃度。

              5. 模板DNA:用本產品,cDNA、基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA等都可作為模板。在添加DNA模板時請注意模板量對PCR擴增的影響。本產品建議添加量為:cDNA添加量不應超過總反應體系的10%;基因組DNA為模板時,為避免在高濃度區域出現線性差的情況,請注意添加量小于500 ng;病毒DNA也可作為PCR模板,添加時請以300 ng為上限;由于質粒DNA濃度和拷貝數很高,在添加PCR模板之前最好進行稀釋梯度試驗,以便確定合適的質粒DNA拷貝數。

              6. 引物:

              建議每條引物工作濃度200 nM-800 nM;為得到高靈敏度定量性的數據,引物的設計非常重要。以下列舉了設計引物時需注意的一般事項。

              a) 引物長度請設定為18bp~30bp、GC含量為40%~65%;

              b) 擴增片段一般小于300bp,請盡量設定在80bp~150bp。過長的片段容易導致擴增效率降低;

              c) 如設計mRNA為目的片段的引物,設計應盡量橫跨內含子,以防止基因組DNA的擴增而引起假陽性;

              d) 請盡量選擇Tm65℃~67℃;

              e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC richAT rich(特別是3'端)。避開T/CPolypyrimidine)或A/GPolypurine)的連續結構;

              f) 避開引物內部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。二條引物間的3'末端避開有2個堿基以上的互補序列;

              g) 引物設計完成后要使用BLAST檢索確認引物的特異性。

              此外,引物的純化純度對反應特異性有很大的影響。經過一般純化、純度較低的引物熒光強度散亂,容易產生非特異性產物,致使熔解曲線出現雜峰。請盡可能使用HPLC級別純化,至少要用經Cartridge(OPC)級別以上純化的引物。

              7. 對照設計:

              1No template controlNTC):qPCR反應體系中僅僅缺少模板。用以檢測有無二聚體和試劑有無污染。

              2Reverse Transcripase control用以評估逆轉錄反應中有無基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。

              ●  使用說明:

              1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix,避免渦旋震蕩,以免產生過多氣泡,徹底混勻后快甩離心將溶液收集到管底。

              2. 按照下表在制備反應體系:

               

              50 μl反應體系

              20 μl反應體系

              終濃度

              2×qPCR MasterMix

              25 μl

              10 μl

              上游引物 10 μM

              1 μl

              0.4 μl

              0.2 μM

              下游引物 10 μM

              1 μl

              0.4 μl

              0.2 μM

              模板

              × μl

              x μl

              10pg-100ng

              補至50 μl

              補至20 μl

               

              3. 快甩離心將反應液收集到管底。

              4. 檢測片段大于300 bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(三步法):

              步驟

              溫度

              時間

              循環數

              初始變性

              95

              30 sec*

              1

              變性

              95

              15 sec

              40

              退火

              55-65

              30 sec

              延伸

              72

              30 sec

              熔解曲線

              使用機器默認采集程序

              檢測片段小于300 bp,qPCR儀上推薦執行以下程序(兩步法):

              步驟

              溫度

              時間

              循環數

              初始變性

              95

              30 sec*

              1

              變性

              95

              15 sec

              40

              退火和延伸

              60

              60 sec

              熔解曲線

              使用機器默認采集程序

              注:由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經過抗體修飾的,初始變性9530 sec即可。

              實驗結果分析

              反應結束后加做融解曲線,以區分擴增產物及引物二聚體。根據擴增曲線和融解解曲線結果可進行PCR定量標準曲線的制作。

              常見問題及處理

              問題

              可能原因

              推薦的解決方法

              無擴增曲線且無擴增產物(凝膠電泳)

              反應體系中有PCR反應抑制劑

              更換或純化模板DNA。

              引物設計不合理

              重新設計、合成引物。

              逆轉錄產物體積過量

              減少逆轉錄產物量以不超過反應體系的10%。

              加樣錯誤或有試劑未加

              檢查是否加了所有的所需試劑。

              引物的降解

              通過PAGE電泳檢測引物完整性。

              退火溫度不正確

              優化退火溫度。

              無擴增曲線但有擴增產物(凝膠電泳)

              qPCR儀設置不正確

              檢查dye selction,reference dye是否選擇正確

              失效的熒光檢測

              熒光檢測應在PCR循環的退火/延伸階段。

              熒光PCR儀問題

              參考qPCR儀器說明書

              陰性對照(NTC)有擴增曲線

               

              反應體系中有污染

              qPCR片段較小,極易造成環境中氣溶膠污染。如果融解曲線分析,解鏈溫度和目的片段相同,凝膠電泳中NTC中的片段大小和目的片段相同,極有可能是反應體系中某一或某些試劑污染所引起的。建議換至沒有污染源的環境進行PCR體系的配制。

              引物二聚體

              進行溶解曲線分析,如果擴增曲線的解鏈溫度小于80,凝膠電泳片段大小和目的片度不符。請重新設計引物。

              提高退火溫度3。

              PCR效率高于110%

              (斜率>-3.1

              有非特異性擴增

              溶解曲線分析非特異性擴增;優化引物設計

              PCR擴增效率低于90%

              (斜率<-3.6)

              反應體系中有PCR反應抑制劑

              更換或純化模板DNA

              PCR擴增條件不合適引起擴增效率降低。

              確認引物濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。

              引物設計

              重新設計引物,避免擴增區域的DNA二級結構。

              實時熒光曲線線性不好

              模板DNA含量較低或過高

              應調整樣品的DNA濃度。

              模板DNA中含有抑制PCR擴增反應的物質

              對模板DNA進行純化或更換模板。

               

               

              質量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA,逆轉錄反應液中所含的物質可能抑制PCR反應。

              請降低樣品濃度,或將樣品純化后再進行反應。建議使用品牌質量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。

              CT值高于預期值

              加入的模板量太少

              適當增加模板量。

              樣品被降解

              檢查樣品的完整性。

              引物不合適

              重新設計合成引物。

              CT值低于預期值

              加入了過多的模板

              減少模板量。

              PCR產物太長

              一般采用100-150bp的產物長度,一般不超過500bp

              CT值的標準差>0.16

              取樣不準確

              每種樣品的反應混合液單獨配制,充分混勻;

              qPCR之前要離心,管壁不要沾有反應液。

              ΔRn值太小

              PCR效率太低

              優化PCR反應條件。

              目標模板數太低

              增加模板量。

              擴增曲線的熒光信號弱,或擴增曲線呈鋸齒狀

               

              PCR的延伸時間過短即熒光讀取時間不充分,熒光收集不能充分完成。

              適當增加延伸時間。

              以少于PCR儀器標準條件的反應體積進行擴增,熒光收集量的誤差會增大

              應增加反應體積以滿足PCR儀器標準。

               



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