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            RTH3102 pfu DNA聚合酶
             產品貨號: RTH3102
             產品名稱: RTH3102 pfu DNA聚合酶
             產品價格/規格: 100U 100元/5×100U 400元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-03-22
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            • pfu DNA Polymerase

              高保真平末端DNA聚合酶

              目錄號

              包裝

              貯存

              RTH3102-02

              RTH3102-03

              100U

              5×100U

              -20


              貯存

                -20保存一年。

              產品簡介

              pfu DNA Polymerase是嗜熱古細菌來源的DNA聚合酶,該酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外,還具有很強的3’-5’外切酶活性,增強了PCR擴增的保真度。與Taq酶相比,pfu聚合酶熱穩定性更好,更能忍耐較高的變性溫度。Pfu的保真性是Taq DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度為0.5kb/分鐘。PCR產物3’端不帶堿基A,為平滑末端,要通過平滑末端克隆法進行克隆。

              產品組成(RTH3102-02

              pfu DNA Polymerase2.5U/μl            40μl

              10×pfu PCR buffer(含Mg2             0.5 ml

              活性定義

              1單位(U) pfu DNA Polymerase活力定義為在74、30分鐘內,以活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質所需的酶量。

              酶貯存緩沖液

              50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol

              適用范圍

              高保真的DNA片段的擴增、DNA片段的平滑化。

              使用說明:

              1. 按照下表在0.2ml PCR管中制備反應體系:

              成分

              20μl反應體系

              50μl反應體系

              終濃度

              Template

              0.04-0.2 μg

              0.1-0.5 μg

              as you wish

              Primer 110 μM

              0.4 μl

              1 μl

              0.2 μM

              Primer 210μM

              0.4 μl

              1 μl

              0.2 μM

              10×pfu PCR buffer(Mg2+)

              2 μl

              5 μl

              dNTP Mixture(10 mM)

              0.4 μl

              1 μl

              200 μM each

              pfu (2.5 U/μl)

              0.4 μl

              1 μl

              0.05U/μl

              ddH2O

              up to 20 μl

              up to 50 μl

              -

              1:如果需要改變Mg2+濃度,根據下表調節

              PCR反應體系中Mg2+終濃度

              2 mM

              2.5 mM

              3 mM

              4 mM

              20μl反應體系中25 mM MgSO4加入量

              0 μl

              0.4 μl

              0.8 μl

              1.6 μl

              50μl反應體系中25 mM MgSO4加入量

              0 μl

              1 μl

              2 μl

              4 μl

              2:配制反應液時,請最后加入pfu,因為本酶有很強的3’-5’外切酶活性,有可能降解引物。


              2. 混勻后,離心快甩將反應液收集到管底。

              3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話,補加25μl礦物油。

              4. PCR儀上執行以下程序:

              步驟

              溫度

              時間

              循環數

              初始變性

              94

              3-5 min

              1

              變性

              94

              30 sec

              25-40*

              退火

              50-60*

              30 sec

              延伸

              72

              0.5kb/min*

              最后延伸

              72

              5 min

              1

              *注: PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況,設定最佳的反應條件(溫度、時間等)。


              ● 注意事項

              1. pfu 酶具有 3-5的外切酶活性,所以 pfu 酶擴增時延伸速度遠比 Taq 酶低,應根據擴增產物的長度設置相應的延伸時間,一般情況下 pfu 酶的延伸速度為每分鐘 0.5kb;同時 pfu 酶的 3-5的外切酶活性可能降解引物,所以應最后把pfu 酶到反應體系中,并立即進行 PCR 反應。

              2. pfu 酶的熱穩定性比 Taq 酶好,對于 GC 含量很高的模板,變性溫度可以提高到98℃,對 pfu 酶的活性無影響。

              使用舉例:

              水稻基因組做模板



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