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            RTE4101 DNA非變性PAGE電泳試劑盒
             產品貨號: RTE4101
             產品名稱: RTE4101 DNA非變性PAGE電泳試劑盒
             產品價格/規格: 45板 0.75mm膠 450元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-04-22
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            •  TBE-PAGE電泳可以選擇RTM441 20bp DNA ladder作為分子量標準。                    


                                DNA非變性PAGE電泳試劑盒(貨號RTE4101  

                                     DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

              產品組成:

              貨號

              名稱

              規格

              保存條件

              AC2913-01

              30%PAA(29:1)

              100 ml

              4

              TB001

              5×TBE

              500 ml

              RT

              AP020P

              APS(干粉)

              5 ml

              RT配制后-20貯存

              TA0761-01

              TEMED

              0.5 ml

              4,避光

              DL070

              6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液

              1 ml

              4

              產品簡介:

              非變性 PAGE 電泳是研究DNA構象變化的常用手段,在非變性條件下DNA的泳動與電荷、片段大小、DNA結合的蛋白及折疊構象都有關系。非變性PAGE電泳是研究單鏈 PCR片段構象多態性(SSCP-PCR,single-strand conformation  polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP測定中,雙鏈DNA(dsDNA)變性為單鏈DNA(ssDNA),每一條單鏈DNA都基于他們的內部序列呈現不同的折疊構象,即使相同長度的單鏈DNA因其堿基順序不同,甚至單個堿基的不同都會形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得到分離。另外,非變性PAGE還可以分離小片段的雙鏈DNA,與瓊脂糖電泳相比,對低于500bp的雙鏈DNA片段有更優秀的分辨率。

              本公司提供的DNA非變性PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑,用戶只需自備制膠器具和蒸餾水,即可配制各種濃度的PAGE膠,使用方便。

              本試劑盒大約可以配制20-45塊常規大。8×10cm)PAGE凝膠,具體數量根據凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制45塊膠,1mm厚度凝膠可以配制至少35塊膠,1.5mm厚度凝膠可以配制至少20塊膠。

              貯存和效期:

                 本產品常溫運輸,按照標簽溫度貯存;有效期一年。

              使用說明:

              10% APS配制-5 ml

              將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中,徹底溶解后分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為一周,-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長,應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

              一、制備凝膠步驟:(以下步驟為制備8×10cm厚度1.0mm膠)

              1.1 參照凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

              1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合;最后加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡。

              1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

              1.4靜置10-20分鐘,待分離膠和水層之間出現一個清晰的界面后,說明凝膠已聚合

              表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,適用于厚度1.0 mm小板膠)

              各組份體積(ml

              最佳DNA分離范圍

              凝膠濃度

              滅菌水

              30%PAA291

              5×TBE

              10%APS

              TEMED

              70-450 bp

              6%

              3

              1.0

              1.0

              0.05

              0.005

              60-460 bp

              8%

              2.66

              1.34

              1.0

              0.05

              0.005

              50-300 bp

              10%

              2.33

              1.67

              1.0

              0.05

              0.005

              40-200 bp

              12%

              2

              2.0

              1.0

              0.05

              0.005

              25-150 bp

              15%

              0.5

              2.5

              1.0

              0.05

              0.005

              5-100 bp

              20%

              0.66

              3.34

              1.0

              0.05

              0.005

              注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長?梢愿鶕h境溫度的不同調節APS的加入量。

              1.5去除覆蓋在分離膠上的水層;按照表二將不同體積成分在一個小燒杯或試管中混合;最后加入10%過硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡。

              表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml,適用于1.0mm厚度膠)

              各組份體積(ml

              凝膠濃度

              滅菌水

              30%PAA291

              5×TBE

              10%APS

              TEMED

              4%

              1.0

              0.2

              0.3

              0.02

              0.002

              1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端;將梳子插入凝膠內,避免產生氣泡。

              1.7靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

              注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長?梢愿鶕h境溫度的不同調節APS的加入量。

              二、電泳:

              2.1 1×TBE電泳液配制:取100ml 5×TBE,加蒸餾水400 ml,即配成500 ml 1×TBE。將凝膠板固定在電泳裝置上,往上槽和下槽中加入足夠1×TBE電泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

              2.2 取待測樣品,加入相應體積6×Native PAGE DNA上樣液,如5 μl樣品加1 μl 上樣液,短暫離

              心后取5-10 μl上樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大小可以選擇20bp DNA ladder(貨號:RTM441)作為DNA Marker。

              2.3 連接電源線,打開電源開關。200 V穩壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達凝膠三分之二位置時結束電泳。

              TBE-PAGE電泳

              恒電壓

              起始電流

              結束電流

              電泳時間

              200 V

              20-25 mA/板膠

              10-15 mA/板膠

              70+min


              三、染色:

              3.1 漂洗:玻璃板上拆下凝膠后,適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。

              3.2 染色液配制:

                TBE-PAGE膠可以使用EBRealSafe類染料后染染色,以下程序用RealSafe Red核酸染料進行染色。即用型染色液配制:

               

              即用型RealSafe核酸染色液

               

              100 ml

              1×TBE

              100 ml

              RealSafe Red核酸染料

              20 μl

              3.3染色:

                凝膠浸泡于即用型染色液中,常溫避光搖床40-60rpm染色30 分鐘。


              五、常見問題:

              1. 為何 SSCP-PCR帶型有復合條帶?

              原因之一:可能是殘留的 PCR 引物跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電泳前將PCR產物進行純化。

              原因之二:可能是PCR產物用量過高,彼此復性。解決辦法是將PCR產物稀釋后4-8倍后使用。 

              2. 如何提高電泳分辨率?

              可以在配膠時加入甘油(終濃度為5%-10%),因為甘油是弱變性劑,能部分展開 DNA 折疊結構,增加表面積,增加電泳時位移差異。但加入甘油后粘性變大,電泳速度變慢,因此只適合常溫電泳使用,不要4℃電泳。如果條件允許,最好同時做加甘油和不加甘油的電泳實驗。


              實驗示例




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