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            ·PCR
             
             





            基因定點突變試劑盒
             產品貨號: RF301
             產品名稱: 基因定點突變試劑盒
             產品價格/規格: 5次/20次 0元/1000元
             產品說明書: 點擊查看
             更新時間: 2022-06-07
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                                   基因定點突變試劑盒
              一、產品簡介:

              本產品采用高保真的pfu酶,通過反向PCR法(Inverse PCR)進行定點突變。以環狀DNA(如質粒)為模板,以反方向設計的兩條引物對質粒進行完整的PCR,pfu DNA聚合酶合成突變鏈;隨后使用GM酶消化PCR產物,降解非突變型質粒模板(甲基化質粒模板),隨后進行轉化感受態細胞,有效地篩選出突變克。▓D一)。


              本產品特征:

              1. 采用部分重疊引物設計(圖二),使PCR呈指數擴增,擴增產物凝膠電泳可見;擴增產物為環狀,易于轉化。

              2. 突變的真實性:可以得到高達95%的突變體。而且,由于采用pfu 高保真聚合酶,PCR過程中的第二位點突變(目標突變以外的突變)的可能性極小。

              二、保存條件:

              -20保存,有效期一年

              三、產品組成:

               

              內容

              RTF3101-015次)

              RTF3101-0220次)

              pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μl

              20 U

              100 U

              2×pfu PCR buffer(含Mg2+

              0.1 ml

              0.5 ml

              10mM dNTP

              15 μl

              50 μl

              GM酶(5 U/μl

              6 μl

              22 μl

              pTGWB(Control plasmid,10ng/μl)

              5 μl

              25 μl

              Control Primer(RV+FW,5 μM each)

              5 μl

              25 μl

              DH5α化學感受態細胞(100μl/支)

              5

              20

              Water(RNase-free,DNase-free)

              1ml

              1ml


              四、使用說明

              1. 引物設計(圖二)

              (1) 共需設計兩條部分序列重疊的引物。引物包含5' 端重疊區和3' 端延伸區。

              (2) 引物長度:兩條引物的長度大約30-45個核苷酸,5' 端重疊區包含15-20個堿基,3' 端延伸區包含至少10個堿基。

              (3) 突變引物:突變點位于兩條引物上;正向引物的突變點位于重疊區下游,緊鄰重疊區;反向引物的突變點位于5' 端。

              (4) 引物GC含量:在可能的情況下,盡量把引物的GC含量控制在40-60%。

              (5) 在可能的情況下,盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。二級結構和二聚體可以通過一些軟件進行分析,如Oligo。

              (6) 最好使用經過PAGE純化的引物或更高純度的引物。

              2. 待突變模板質粒的選擇:

              必需使用從dam的大腸桿菌(這類菌中質?梢员患谆)中抽提得到的質粒用于基因定點突變,如DH5α、JM109等。

              選擇GC含量在40-55%的待突變模板質粒,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果GC含量過高,請先把目的基因克隆到其它合適的載體上,再進行基因定點突變反應。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范圍,并且每一個50bp左右的局部GC含量最好也不超過70%。如果目的基因GC含量過高,而突變位點不在高GC含量區域,可以先把該基因的不含高GC含量的一個區域克隆出來,進行定點突變,然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的質粒模板,或者有局部高GC含量的質粒模板,請另外使用專門用于高GC含量模板的PCR反應試劑。

              3. 對照質粒:

              本試劑盒中含有對照質粒(pTGWB),其LacZ基因已經突變,第6個氨基酸密碼子突變為TAA(終止密碼子)(圖三)。當被轉化入大腸桿菌后,在X-Gal板上形成白色菌落。利用試劑盒添附的對照引物進行突變反應后,該密碼子可從TAA(終止密碼子)恢復為CCAPro),轉化后可在X-Gal板上產生藍色菌落,這樣就可以簡單地確認突變反應是否正確進行。根據本實驗操作步驟進行該突變反應,通?色@得80%以上的藍色菌落。



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